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    cDNA*鏈的合成

    更新時間:2013-03-09點擊次數(shù):1466

    [方法]
    1.為合成cDNA*鏈,在1個1.5ml硅化微量離心管中制備以下反應混合液,
    ● 10-RT緩沖液,5ul
    ● 20×dNTP, 5ul
    ● 100mmol/LDTT, 5ul
    ● Hu IgMFOR引物,2ul
    ● HuCκFOR引物, 2ul
    ● HuCλFOR引物, 2ul
    ● RNAsin,80U(2ul)
    ● 所有引物濃度均為10pmol/ul
    2.取整數(shù)體積(1~4ug)存于乙醇中的RNA,放在1個無菌1.5ml微量離心管內(nèi),并用微型離心機離心5分鐘。 用70%乙醇洗滌沉淀1次, 晾干, 并用24.5ul DEPC重懸。
    3.將溶液加熱到65℃持續(xù)3分鐘,使RNA變性;冰上放置2分鐘冷卻,并加入到*鏈反應混合液中。加入2.5ul AMV反轉錄酶,42℃孵育1小時。
    4.煮沸cDNA混合反應液,3分鐘。用微型離心機離心5分鐘。將含有cDNA的上清液轉移至新的硅化管內(nèi),并用它盡快進行V基因的PCR擴增。