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    scFv和載體DNA的連接

    更新時間:2013-03-07點擊次數(shù):1386

    [器材和試劑]
    ●T4DNA連接酶及10×緩沖液(NEB)
    ●酚/氯仿(Sigma)
    ●100%和70%乙醇,-20℃保存
    ●消化的載體和scFv文庫
    ●TE(10mmol/L Tris pH 8,lmmol/L EDTA)

    [方法]
    1.如下所述,配制兩個100ul連接混合液,其中1個用于VH-VκscFv文庫,另1個用于Vu-VλscFv文庫,并設(shè)置兩個對照反應(yīng)。對照可以確定未切的載體有多少(對照2),以及確定無插入序列時有多少重新連接的載體(對照1)。要保持恰當?shù)谋壤?,所獲得的克隆數(shù)(對于相同的連接體積)應(yīng)當小于基因文庫的10%。
    對照1 對照2
    ●10×連接緩沖液 10ul 0.5ul 0.5ul
    ●Millipore水 32ul 2.3ul 2.5ul
    ●已消化的pHENl 100ng/ul 40ul 2.Oul 2.0ul
    ●ScFv基因文庫(100ng/ul) 14ul
    ●T4 DNA連接酶(400U/ul) 4ul 0.2ul
    2.孵育混合液,16℃過夜。
    3.加入TE使反應(yīng)混合液體積增加至200ul。用等體積酚/氯抽提DNA。用乙醇沉淀DNA并用70%乙醇洗滌沉淀2次。