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    利用血清篩選噬菌體文庫交叉抑制實(shí)驗(yàn)

    更新時(shí)間:2013-03-16點(diǎn)擊次數(shù):1451


    [器材和試劑]
    ● 多孔板(Immuno plate Maxisorp,Nuno)
    ● TBS
    ● PEG—純化噬菌體
    ● PBST
    ● 封閉液(含5%脫脂牛奶,0.05%Tween—20,0.02%NaN3的PBS)
    ● XLl—Blue細(xì)菌提取物
    ● 堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗人IgG(Fc特異性)抗體(Sigma)
    ● 底物緩沖液(10%二乙醇胺,0.5mmmol/L Mg-2,0.05%NaN3, 用HCl調(diào)節(jié)至pH 9.8)
    ● 顯色液(在底物緩沖液中加1mg/ml p硝基苯磷酸)
    ● 自動(dòng)酶標(biāo)儀

    [方法]
    1.將100ul含有2 ×1010個(gè)PEG—純化噬菌體顆粒的TBS,等量分加到多孔板各孔中,4℃孵育12小時(shí)。
    2.用PBST洗滌數(shù)次,在室溫下每孔加250/ll封閉液封閉2小時(shí)。
    3.用封閉液稀釋血清,其中含1×1010個(gè)/mlMl3噬菌體顆粒、50ul/ml的XLl—Blue細(xì)菌提取物以及2×1011個(gè)顆粒/ml PEG純化抑制子噬菌粒克隆, 室溫預(yù)孵育3小時(shí)。
    4.除去板中封閉液,將預(yù)孵育的血清混合物加到噬菌體包被孔中,并在室溫下孵育3小時(shí)。
    5.用PBST充分洗滌。
    6.每孔加100ul堿性磷酸酶標(biāo)記二抗,用封閉液按l:5000比例稀釋,并在室溫下孵育2小時(shí)。
    7,用PBST洗板數(shù)次,用底物緩沖液洗滌一次。
    8.每孔加入100ul含lmg/ml p硝基苯磷酸的底物緩沖液,以顯示堿性磷酸酶反應(yīng)。