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    從預制的入GTll文庫中制備cDNA插入片段

    更新時間:2013-03-12點擊次數(shù):1623

    [方法]
    A.PCR擴增cDNA插入片段
    1.在冰浴中將以下成分加到0.2m1微量離心管中(執(zhí)行10步反應)
    ● 水,36.5ul
    ● 10×Pfu緩沖液,5.0ul
    ● 10mmol/L dNTP, 1.5ul
    ● λGTll正向引物 (10umol/L),2.5ul
    ● λGTll反向引物(10umol/L),2.5ul
    ● 已制備好的Sfi-NotIλGTll cDNA文庫,1.Oul
    ● PfuDNA聚合酶(2.5U/ul),1.0ul
    2.混合反應物并用50ul的礦物油覆蓋。
    3.在95℃下使模板變性2分鐘,按如下操作執(zhí)行25次循環(huán): (a)95℃變性1分鐘; (b)50℃退火1分鐘;(c)72℃延伸3分鐘(zui后一輪的延伸時間增加到7分鐘)。
    B.純化并用限制性內(nèi)切酶消化擴增的cDNA1.純化在A部分中用QIAquick PCR擴增儀器得到了PCR產(chǎn)物,每兩個PCR反應用一個旋轉(zhuǎn)柱并在30ul的水中提取純化的PCR產(chǎn)物。
    2.收集提取的PCR產(chǎn)物,如下所示建立限制性消化:
    ● 水,25ul
    ● 純化的PCR產(chǎn)物,150ul
    ● 10X限制性內(nèi)切酶緩沖液,20ul
    ● 限制性內(nèi)切酶(10U/ul),5ul
    3.在適當?shù)臏囟认?小時。
    C.對擴增和消化的cDNA按大小進行分餾并重新獲得cDNA1.在0.8%(w/v)瓊脂糖/TAE凝膠(允許電壓為1~5V/cm)上純化限制酶的消化產(chǎn)物。
    2.用無菌刀小心地切除靶區(qū)域(500~3000bp),將凝膠片轉(zhuǎn)移到15ml的聚丙烯管中。注意:增加了跑膠時間會導致靶區(qū)域的擴大。
    3.用Geneclean或WizardPCRDNA預純化系統(tǒng)來純化瓊脂糖凝膠分離的片段,在50ul的水中重新得到擴增的cDNA。
    4.用DNA濃度測量試劑盒來估計DNA的濃度。