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    對(duì)scFv基因文庫及pHEN1噬菌體展示栽體的限制性消化

    更新時(shí)間:2012-12-29點(diǎn)擊次數(shù):1742

    [方法]
    1,配制兩個(gè)100ul PCR反應(yīng)混合液來消化scFV文庫,其中1個(gè)用于VH-VκscFv文庫,另1個(gè)用于VH-Vλ scFv文庫,該混合液含有:
    ●scFV DNA(1~4ug),50ul
    ●水,33ul
    ●10×NEB 3緩沖液,10ul
    ●乙酰BSA(100×),1.0ul
    ●Nco工(10U/ul),3.0f11
    ●NoJ工(10U/ul),3.0ul
    2.37℃孵育反應(yīng)液過夜。要用37℃孵育箱或者有加熱蓋的加熱裝置,防止水分蒸發(fā)。或者,可以按PCR反應(yīng)那樣加一層礦物油(Sigma)。
    3.用1%瓊脂糖膠純化基因文庫,并用Geneclean試劑盒提取DNA。重懸產(chǎn)物于30ul水中。在1%瓊脂糖凝膠中,與已知大小和濃度的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品比較,測定DNA濃度。
    4.消化4ug氯化銫純化的pHENl DNA以準(zhǔn)備載體,其過程*如上述消化scFv基因文庫的流程,但須將scFvDNA替換為質(zhì)粒DNA②。
    5.用0.8%瓊脂糖膠純化已消化的載體DNA,再按處理scFv插入序列的方式,用Gene-clean自膠中提取載體片段。將產(chǎn)物重懸于30ul水中。在1%瓊脂糖凝膠中,與已知大小和濃度的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品比較,測定DNA濃度。